米老排子叶节再生体系的建立
杨贺月,郑明扬,杨恩点,杨智添,张俊杰*(华南农业大学林学与风景园林学院,广东广州510642)
摘要:米老排是优良的速生树种,是油脂和饲料的来源,具有重要的商业价值。以米老排种子为材料,筛选最佳灭菌方式,再以无菌苗子叶节为外植体,研究培养基中的植物生长调节剂组合、外植体的苗龄、切割方式和光质对子叶节不定芽诱导的影响。结果表明,种子最优消毒方式为75%乙醇1min+7.5%次氯酸钠15min,此时污染率为10.00%,萌发率为86.67%;以无菌苗子叶节为外植体,在MS基础培养基中添加6.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBA不定芽再生效果最佳,子叶节不定芽诱导率为100%,平均每个外植体产生4.67个不定芽。此外,苗龄的增加、切割方式和光质的改变都是影响不定芽诱导的因素。最佳生根方式为在MS基础培养基中添加0.1mg/LIBA,不定芽生根率最高,达77.78%、生根系数为3.94,炼苗移栽成活率在85%以上。该结果可为米老排的遗传转化、转基因和良木遗传育种的研究提供技术参考。
米老排(Mytilarialaosensis)别名壳菜果,是一种常绿阔叶乔木,树冠伞形,树干通直。主要分布于中国广东、广西等地,是优良的速生用材树种[1]。米老排树干生物量大[2-4],材性优良,成材较早、出材量多,适于制作家具和胶合板等[5-6]。而且米老排叶片肥大嫩绿,含有16种氨基酸,富含粗纤维、粗蛋白和维生素等,营养成分含量高,能满足动物生长发育[7-8],是一种具有发展潜力的木本饲料。另外,米老排还具有保持水土、涵养水源、改善土壤理化性质和做防火林带等生态功能特性。广泛种植米老排具有较高的生态效益。
目前,米老排以种子实生苗繁育为主,不但需要较长时间,而且受季节限制。随着米老排的开发与应用前景越来越广泛,迫切需求高效稳定的快速繁殖体系。关于米老排组织培养,目前仅有茎段快繁一种方式[9-11],
茎段快繁污染率和褐化率较高,存活率较低,体系不稳定。采用米老排无菌实生苗的子叶节作为外植体,取材方便,不受季节和天气影响,能克服污染率和褐化率高的问题,且子叶节再生潜力大,以此构建一套稳定的再生体系,可为促进米老排无性系林业发展提供技术支撑。
本研究以米老排无菌实生苗子叶节为外植体,研究植物生长调节剂、苗龄、切割方式和光质等因素对不定芽诱导的影响,接着探究不定芽最适的生根培养基配方,并对再生植株进行炼苗移栽,旨在建立一套高效、稳定的米老排不定芽再生体系,为米老排的无性繁殖和遗传转化提供技术支持。
1材料和方法
1.1试验材料和培养条件
米老排种子采于广东省韶关市乐昌林场,将种子存储于4℃种子柜备用。本试验中均用MS培养基且附加30g/L蔗糖和6g/L琼脂,用NaOH或HCl将试验中所有培养基pH调至5.8~6.0,并进行高压灭菌20min(12℃,0.1MPa)。试验材料都放置在无菌组培室内培养,组培室为冷白光(2500Lx),光照时间为12h/d,温度为25±2℃,湿度在70%左右。
1.2种子灭菌方式探索


将米老排种子去除外壳,用洗洁精浸泡2min,流水下冲洗30min,在超净工作台上用75%乙醇灭菌1min,无菌水洗3次,接着用6种灭菌方式分别处理种子(如表1),最后用无菌水摇晃清洗多次。播种于无激素培养基中,每瓶1个种子,每种灭菌方式60瓶。
1.3植物激素对不定芽诱导的影响


米老排播种30d后,无菌苗长出第1片真叶时,取无菌苗的子叶节作为外植体(图1a),接入不同配方的8种培养基中,在最优培养基的基础上考察培养条件对子叶节不定芽的影响(如表2),每组处理接种15个外植体。


1.4苗龄、切割方式和光质等培养条件对不定芽诱导的影响
在筛选出子叶节不定芽诱导的最优激素组合的培养基上,对培养条件考察,考察苗龄、切割方式和光质对子叶节不定芽诱导的影响(如表2),每组处理接种15个外植体。
1.5组培苗的生根培养


当不定芽长至2cm左右时,将其切下,接种到含有不同种类生长素和浓度的MS培养基中(如表3)。每个处理接种15个外植体。
1.6炼苗移栽
选取生根良好的再生苗,将其培养瓶的瓶盖拧松,加入纯净水,在组培室炼苗3d左右,将幼苗小心地从培养瓶中移出,用清水洗净根部。在尽量不损伤根系的情况下,把再生苗移栽到湿润的无菌基质(W泥炭土︰W珍珠岩=3︰1)中,盖上透明塑料盖,为幼苗保持湿润的生长环境。完成移栽后将幼苗放在温度25℃,光照强度为2500Lx的温室中。观察小苗2~3周,待长出新叶,标志着再生苗已经移栽成活。
1.7数据统计
所有数据的平均值和标准误差使用SPSS23.0软件对数据进行差异显著性分析,差异显著性水平P值<0.05为显著性。
2结果与分析
2.1不同灭菌方式对米老排种子的影响


由表5可知,播种10d后,使用次氯酸钠灭菌效果优于升汞。次氯酸钠处理种子20min时污染率最低,为6.67%,处理15min时萌发率最高,为86.67%;而升汞处理种子5min时污染率最低,为20.00%,萌发率最高,为63.33%,并且随着升汞灭菌时间的延长污染率上升,萌发率降低。所以,米老排种子灭菌处理不适合采用0.1%升汞。次氯酸钠处理中1号灭菌方式污染率较低,为10.00%,萌发率为86.67%,因此,米老排种子最佳灭菌方式为7.5%次氯酸钠处理15min。
2.2植物生长调节剂对不定芽诱导的影响


由表6可知,接种50d后,当生长素IBA为0.5mg/L或1.0mg/L时,诱导率和不定芽数随6-BA浓度的升高呈现先增加后降低的趋势;3号培养基诱导率最高、不定芽数最多、生长状态最好;综合诱导率、不定芽数和长势,在6-BA为6.0mg/L、IBA为0.5mg/L时为最优诱导不定芽的培养基配方,其不定芽的诱导率和不定芽数分别为100%和4.67个,不定芽健壮,叶片舒展(图1b)。
2.3苗龄、切割方式和光质等培养条件对不定芽诱导的影响


2.3.1外植体年龄对不定芽诱导的影响。在MS+6-BA6.0mg/L+IBA0.5mg/L培养基上进行不同苗龄对子叶节不定芽诱导的影响试验。由表7可知,接种50d后,诱导率和不定芽数随苗龄的增加表现出降低的趋势,诱导率和不定芽数最高的为1号苗龄的子叶节。3个苗龄处理差异不显著,不定芽都生长良好。综合来看,运用1号30d苗龄的子叶节为最佳。

2.3.2不同切割方式对子叶节不定芽诱导的影响。由表8可知,切割方式对子叶节不定芽诱导的影响很大。接种50d后,2种切割方式的诱导率和平均芽数差异显著。1号的诱导率为100.00%,平均芽数为4.67,而2号的诱导率为25.00%,平均芽数0.50个,并且生长褐化。说明1号子叶不分离能在一定程度上提高子叶节外植体的诱导效率.因此,子叶不分离去除顶芽,切除子叶的2/3是米老排子叶节不定芽诱导的最佳操作。


2.3.3光质对子叶节不定芽诱导的影响。由表9可知,接种50d后,4种光质诱导率和不定芽数差异显著,诱导率和不定芽数表现出一样的趋势,从多到少依次为白光>红光>蓝光>绿光;外植体对3号绿光的反应最差,其诱导率和不定芽数分别为63.64%和0.82,且表现出玻璃化现象。综合来看,外植体在1号白光诱导下表现最佳状态。
2.4激素对不定芽生根的影响


由表10可知,接种40d后,1号培养基生长素为0时,生根率和平均根数也为0,且外植体没有明显变化;2、3、4号添加了NAA生长素后,生根率随着NAA浓度的增加呈先升后降的趋势,生根系数呈现出先升高后降低的趋势,3号培养基在NAA为0.5mg/L时较高,生根率为70.00%,生根系数为3.60,但根系较弱,愈伤较大;5、6、7号添加IBA后的培养剂生根率和生根系数表现出高低高的趋势,在5号用量为0.1mg/L时达到最大值,生根率、生根系数分别为77.78%、3.94,并且无愈伤,根系较长(图2a)。

2.5炼苗与移栽
移栽1个月后成活率在85%以上,并且植株生长健康(图2b)。
3结论与讨论
3.1消毒方式和时间对种子污染和萌发的影响
本研究发现,次氯酸钠灭菌处理米老排种子的效果优于升汞溶液,可能是因为米老排种壳特别坚硬且又在开放的环境中去除外种皮,去除外种皮时会不小心损伤内种皮,这样就很容易携带杂菌进入损伤的内种皮空隙中,而升汞毒性大,进入损伤的种胚中附着于损伤处,清洗时又难以彻底去除消毒液,所以造成种胚毒害难以发芽,这与訾智博[12]、杨超尘等[14]的研究结果相似。因此,本试验以7.5%次氯酸钠灭菌15min的效果最佳,种子萌发率为86.67%,污染率为10.00%。
3.2植物生长调节剂对不定芽的影响
本试验中6-BA的使用浓度对不定芽具有重要影响,6-BA为0mg/L时诱导的平均不定芽数只有0.92个,随着6-BA浓度的增加,不定芽数也随之增加。当6-BA浓度超6.0mg/L时,不定芽诱导率和不定芽系数下降。因此,在米老排子叶节直接诱导不定芽发生过程中,培养基中添加细胞分裂素6-BA占据主导作用是诱导不定芽产生的关键[15]。当IBA浓度超过0.5mg/L时,不定芽诱导系数也在降低,说明生长素IBA浓度较低时有利于不定芽发生。本试验中未考察其他分裂素对米老排子叶节不定芽的诱导,其他细胞分裂素是否与6-BA具有同样效果,有待进一步研究。本研究通过器官发生途径建立了较高效稳定的植株再生体系,其不定芽发生率和不定芽数分别可达100%、4.67个。据报道,6-BA常用浓度范围为0.5~3.0mg/L,浓度过高很可能会导致诱导出不定芽染色体加倍[16],而本试验最佳浓度为6.0mg/L6-BA,诱导出的不定芽染色体是否加倍,需要进一步验证。
3.3苗龄、切割方式和光质等培养条件对不定芽诱导的影响
3.3.1苗龄对不定芽诱导的影响不同植物在离体培养过程中最适外植体苗差异较大。本试验结果表明,30d苗龄子叶节的诱导效果强于45d和60d,但差异不显著。并且发现诱导率和不定芽系数随着苗龄的增加而下降,可能是不同苗龄的外植体细胞内部基因表达不同,苗龄小的外植体有着更活跃的分化细胞和更强的再生能力[17-18]。
3.3.2切割方式对不定芽诱导的影响。子叶节的不同切割处理方式对不定芽增殖系数有很大的影响。郑宝仁等[19]在研究苜蓿子叶节离体再生时,设置了6种子叶节切割方式来观察切割对子叶节不定芽诱导的影响,
结果是子叶切除1/3(子叶不分开去除顶芽)的切割处理方式的外植体出芽数最高,这与本试验最佳的切割方式相似。在林木组织培养中褐化的影响因素有外植体的遗传特性及生理状态和培养基与培养条件[20]。
本试验中,子叶分开方式的切割处理,发现外植体褐化不能正常生长,而子叶不分开的方式生长情况较好。可能是因为外植体幼嫩且较短,内含致褐物质较高[21],并且2片子叶分开时产生的切割创伤面与体积太大造成的外植体褐化[22]。因此,本试验对外植体的最佳切割方式为子叶不分开去除顶芽,切除子叶的2/3。
3.3.3光质对子叶节不定芽诱导的影响。光是影响植物生长发育的重要因素之一。元博雅[23]在研究粉色蜡花中发现,红蓝光处理相较于白光具有抑制愈伤组织生成的作用,而在纯蓝光的照射下增殖系数和株高达到最大值,明显地表达了蓝光促进粉色蜡花的伸长生长。
本研究中,对比组培室的白光,各处理红、绿、和蓝光都抑制了米老排子叶节不定芽的再生效率,显著地降低了不定芽个数。尤其是绿光影响下其诱导率和平均不定芽数达到最低值,且表现出玻璃化状态。米老排子叶节诱导的不定芽个数对白光表现出较好的效果、对绿光表现出抑制的现象,这与张小芳[24]和苏恒[25]的研究相一致。
3.4生长素对不定芽生根的影响
本试验中植物激素的添加对不定芽生根效果有很大的影响,单独添加IBA、NAA均能诱导米老排组培苗不定根的产生,但添加IBA明显好于添加NAA的生根效果。在生根培养基中添加NAA,外植体基部首先长出愈伤组织,愈伤组织处会冒出生长缓慢的毛细根,这样的根较细、长势弱,不适合后续的幼苗驯化。而在培养基中添加生长素IBA,无愈伤组织产生,根系直接从外植体基部长出,且诱导出的根粗壮、长势强,这与王世鹏等[13]、陈娜[26]等、陈春利等[27]、王婧宇等[28]的研究有相似的结论。(收稿:2024-03-29)