丛枝菌根真菌与印度梨形孢对枳生长与养分的影响
杨柳，姚博翰，唐依伟（长江大学文理学院，湖北荆州434020）
摘要：柑橘是我国南方地区广泛种植的重要果树，目前柑橘栽培多使用嫁接苗。枳是主要的柑橘砧木，生产中多种植于贫瘠的丘陵或山地，丛枝菌根真菌（Arbuscularmycorrhizlafungi，AMF）是植物根系中最常见的共生内生真菌，在促进植物生长、加速营养物质的获取和养分的吸收等方面起着重要作用。但由于AMF不能离体繁殖，限制了其在柑橘中的应用。本研究试图将一种可离体培养内生真菌的印度梨形孢（Piriformosporaindica，P.indica）应用于枳上，通过分析植株生长状况、磷含量、根系和土壤磷酸酶活性等，明确P.indica在枳上对磷促进效益；并与丛枝菌根真菌摩西管柄囊霉（Funneliformismosseae；F.mosseae）进行对比。20周后，P.indica可在枳中定殖，且P.indica和F.mosseae同时存在于根中。与不接种相比，单一或双重接种共同改善了植物生长，包括株高、叶数和生物量（叶、茎和根）。此外，单次真菌处理提高了根系N、P和Mg含量，双次接种仅提高了Mg和B含量。单次接种对生长和养分的积极影响比双重接种更显著。综上所述，P.indica与F.mosseae对枳的植株生长和磷的获取具有促进作用，同时作为生物肥料在柑橘领域的应用具有巨大潜力。
丛枝菌根真菌（AMF）是土壤微生物之一，可与约72%的陆地植物的根系建立互惠共生关系。菌根作为土壤和根系之间的活桥梁，将土壤中的水分和矿质养分吸收到植物体中[1]。早期的研究证实了AMF对寄主植物养分获取的刺激作用，包括磷、氮、钾、铜、锌和硫[2]。有研究表明，从柑橘根际分离的菌根接种剂显著提高了三叶橙幼苗叶片P、K、钙、镁和锌的含量。菌根对磷的吸收速率是根毛的6倍，而磷在菌根菌丝中的转移速率是根毛的10倍。此外，AMF膜中磷脂为寄主植物提供了一个有机磷库[3]。除了AMF，印度梨形孢作为一种内生真菌，在菌丝尖端的酸性磷酸酶获取营养和有机酸积累方面也发挥着重要作用。接种印度梨形孢后观察到番茄和甘蓝的营养元素提高。在有关香蕉的研究中，接种印度梨形孢提升了物植物生长和营养吸收的能力，增加了茎和根生物量和P含量，但没有增加N含量。而柑橘中的促进机制仍需要研究证明。
有研究表明，柑橘依赖土壤AMF形成菌根共生，菌根共生部分取代根毛吸收养分[4]。然而，AMF的一个重要缺点是，在没有寄主植物根的情况下，AMF不能再离体培养，从而限制了其作为菌根肥料的应用。与AMF不同的是，印度梨形孢可以在没有植物根的人工培养基中生长。在这样的背景下，本研究单独接种印度梨形孢，双接种印度梨形孢、AMF定殖在枳根的可能性和稳定性，从而促进植物的生长和营养吸收。这些结果将为微生物菌剂在柑橘栽培中的应用提供一条新的途径。
1材料与方法
1.1试验材料
丛枝菌根真菌由“中国丛枝菌根真菌种质资源库（BGC）”提供。以白三叶草为寄主植物，盆栽繁殖3个月。在收获时，除去茎，收集根和土壤基质作为菌根接种物，其中包括AMF定殖的根段、孢子、孢子实和土壤AMF菌丝。每1g菌剂中约含有23个真菌孢子，每个AM真菌接种处理接种80g菌剂。
P.indica由长江大学生命科学学院田志宏教授友情提供。将大小为5mm×5mm的真菌块在30℃的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基上接种7d，然后转移到新的PDA片上，在30℃下激活真菌1周。将5mm×5mm的活化菌丝体接种于马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基上，在30℃、150r/min条件下黑暗培养7d。用抹刀轻轻刮拭培养皿上的真菌表面，收集孢子悬浮液。用粗棉布过滤孢子悬浮液，去除多余的培养基，用含有0.05%Tween-20的ddH2O洗涤数次，以4000×g/min离心7min。最后将孢子球再次悬浮在ddH2O中，与蒸馏水按1∶20的比例混合。用分光光度计计算孢子数，浓度为3.27×108CFU/mL（OD600=0.23）。
1.2试验设计
试验分为4个处理：①不接种作为对照处理；②单次接种P.indica；③单次接种F.mosseae；④双重接种F.mosseae+P.indica。4个处理各重复10次，共40盆（每盆3株枳实生苗）。
1.3试验过程
将枳种子用70%乙醇溶液消毒10min，蒸馏水洗涤，然后在28℃高压灭菌（121℃，0.1MPa,1h）砂中发芽1个月。选取4~5叶龄的无菌枳实生苗移栽至塑料盆（上口内径13.5cm、盆底内径9.5cm、盆高11cm），
每盆含基质1.5kg。罐中装有1.5kg蒸压过的土壤和沙子基质（体积比5︰3）。生长基质的理化特征为pH值6.4、有机碳8.5g/kg、速效氮10.0mg/kg、磷14.6mg/kg。移栽时，取80g菌剂F.mosseae接种在花盆中。种植时，在盆栽中接种20mL的P.in-dica孢子悬浮液作为单株P.indica菌种。接种80g的AMF作为单株F.mosseae菌种。双接种为80g菌剂F.mosseae和20mLP.indica孢子悬浮液。对照处理不接种以上2种菌种。试验在温室进行，光合光子通量密度为880μmol/m2·s，昼夜温度28℃/21℃，空气相对湿度68%。
1.4指标测定
收获植株后使用卷尺测定枳实生苗株高，游标卡尺测量茎粗，人工计数叶片数。随后将地上部与地下部分别置于天平称重，再使用卷尺测量主根直径和主根长，人工计数各级侧根数量。
根矿质元素含量的测定采用Zhao等[5]提出的方法，电化学分析仪（Smartchem200）。采用ICP光谱仪对根中P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn和B等不同营养物质按标准程序在二酸混合物中消化后进行含量分析。
根系酸性磷酸酶活性采用Mclachlan,K.D等[6]提出的硝基苯磷酸底物法测定。土壤酸性、中性和碱性磷酸酶分别用0.1mL醋酸钠缓冲液（pH值5.0）、20mL柠檬酸缓冲液（pH值7.0）和0.2mL硼酸缓冲液（pH值10.0）提取，并根据Wu等[7]的方案进行检测。
1.5数据分析
运用SPSS17.0软件的ANOVA模块对不同处理间作显著性分析，然后采用Duncan新复极差法进行多重比较分析（P＜0.05）。
2结果与分析
2.1F.mosseae（以下简称F.m）与P.indica接种对枳真菌发育及植株生长的影响
由图1可知，在未接种AMF的处理中并未发现菌根结构的存在，而在AMF接种处理植株根系有菌根侵染结构，在P.indica接种处理植株根系中有厚垣孢子侵染（图1）。真菌侵染率在28.82%~62.68%之间（表1），根真菌侵染率按照降序排列依次为F.m＞P.in-dica＞F.mosseae+P.indica。在F.m定殖的植物中，观察到典型的丛枝菌根结构———菌丝和丛枝（图1a）。在接种P.indica的植株中，在根皮层细胞中发现大量透明梨形孢子，而没有观察到菌丝（图1b）。在双接种的植株中，发现菌根结构和梨形孢子（图1c），表明这2种内生真菌在枳根中共存。与F.m处理相比，双接种（F.m+P.indica）处理降低了54%的植株真菌侵染率。
此外，接种AMF与接种P.indica均显著促进了植株生长。与未接菌处理相比，接种F.m能显著提高茎粗、株高、叶片数、叶、茎，分别提高了27.8%、53.2%、38.1%、83.3%、89.3%；接种P.indica能显著提高茎粗、株高、叶片数、叶、茎，分别提高了13.9%、50.3%、28.6%、77.8%、78.7%，双接种能提高茎粗、株高、叶片数、叶、茎，分别提高了5.7%、53.1%、23.8%、74.1%、76.0%。在3种接种处理中，接种F.m对植株生长的促进作用相对优于单接种P.indica或双接种F.m+P.indi-ca；但是接种P.indica能显著提高根生物量。
2.2接种F.m与P.indica对枳实生苗根系与土壤磷酸酶的影响
由表2可知，与未接种处理相比，单接种F.m和P.indica显著提高了根系磷酸酶活性，分别提高26.2%、13.8%，而双接种根系磷酸酶活性下降，下降了5.3%。与未接种相比，接种真菌处理均提高土壤酸性、中性、碱性和总磷酸酶活性，其中接种P.indica提高了土壤酸性、中性、碱性和总磷酸酶活性，分别提高了8.5%、6.5%、10.8%和7.8%，F.m则分别提高了10%、17.4%、15.1%和14.1%，双接菌则分别提高了5.4%、2.2%、9.1%和7.0%，单接菌F.m处理的效果相对优于其他2种接种处理。
2.3接种F.m与P.indica对枳实生苗矿质元素含量的影响
由表3可知，与未接种处理相比，接种P.indica显著提高了根系N、P、K和Mg含量，分别提高了22.4%、16.0%、20.7%、38.0%；接种F.m显著提高了根系N、P、B和Mg含量，分别提高了19.5%、39.9%、91.1%、32.1%；双接种显著提高根系Mg和B含量，分别提高了42.6%、102.9%。此外，接种F.m根的P含量显著高于单接种P.indica和双接种，分别提高20.6%、29.6%。与未接种处理相比，单接种F.m、P.indica和双接种显著降低了根Mn含量，分别降低了13.0%、3.7%、15.6%。单接种P.indica和双接种显著降低了根Cu含量，分别降低了23.0%、46.8%。
3结论与讨论
本研究发现，除了AMF，枳的根系还可被印度梨形孢定殖。印度梨形孢有广泛的寄主植物。在3种微生物接种中，根真菌定植量显著高的趋势依次为F.mosseae＞P.indica＞双接种。2种内生真菌可以同时定殖在枳的根上，但与单次接种相比，双次接种相对抑制了真菌的定殖。Deshmukh等[8]报道了印度梨形孢位于大麦根的死根皮细胞和皮层细胞中。因此，印度梨形孢需要寄主细胞死亡才能增殖，这适当地减少了F.mosseae在根上的定殖。此外，寄主植物的活性氧产生和抗氧化防御系统可能会影响2种内生真菌定殖的顺序。在本研究中，在接种真菌2个月后发现，在F.mosseae定殖植物中存在大量菌根内菌丝、囊泡和丛枝，而在P.indica定殖植物中则很少甚至没有梨形孢子。因此，未来的研究需要在枳根中研究2种内生真菌侵染的先后效率。
菌根可促进包括柑橘在内寄主植物的生长。研究表明，F.mosseae对枳的生长有积极的影响。根内生真菌P.indica也能促进包括拟南芥在内的多种寄主的植物生长。在枳中接种P.indica显著提高了株高、叶数和生物量（叶、茎、根），且对生长的改善程度与AMF处理相当。该结果与早期对香蕉和芦荟的研究一致。因此，F.mosseae和P.indica可作为柑橘类植物的生长促进剂。微生物制剂对植物生长的促进作用与生长素有关。
AMF的一个重要作用是促进寄主植物对矿物质营养物质的吸收。本研究中，接种F.mosseae显著提高了三叶橙根系中N、P、Mg和B的含量，这与以往的研究结果一致[9]。与未接种处理相比，根内生真菌对三叶橙的N、P、K、Mg含量也有提高作用。双重接种对根中Mg和B含量也有积极的促进作用。在由P.indica和AMF定殖的菠萝苗中也发现了类似的结果。早期的究也表明，P.indica对大麦、烟草和绿豆的N、P含量没有影响，而对菜籽和番茄的N、P、S、Zn、Mg含量有提高作用[10]。由此可见，根内生真菌对寄主的营养获取具有一定的作用，其作用依赖于寄主类型和内生真菌种类。
有机磷矿化的衍生是由根系和土壤微生物分泌的磷酸酶引起的。本研究表明，接种内生真菌可共同促进土壤酸性、中性、碱性和总磷酸酶活性，并提高根系磷含量。早期的研究表明，磷酸酶存在于AMF菌丝和丛枝中[11]。一旦AMF死亡，AMF特异性磷酸酶包括酸性磷酸酶和碱性磷酸酶被释放到根际，提高土壤磷酸酶的活性。真菌接种植株根际土壤磷酸酶活性提高，可促进有机磷矿化，使寄主植株磷含量提高。共生真菌的双重接种似乎主要通过调节土壤磷酸酶的产生来刺激寄主对磷的获取。（收稿：2024-03-03）
