摘 要: 应用聚合酶链式反应 － 变性梯度凝胶电泳( PCＲ － DGGE) 方法对三叶赤楠、火棘、三角枫、鸡爪槭和金边瑞香这 5 种江西特色盆景树种根际微生物特征进行了比较研究。结果表明: PCＲ － DGGE 对于盆景树种根际微生物特征响应良好，DGGE 图谱可以明显反映出 5 种盆景树种根际微生物的差异。不同树种根际微生物特征有很大区别，鸡爪槭、三角枫根际微生物多样性指数最高，为 3. 121 和 2. 876，并且根际微生物群落相似程度很高; 而火棘根际微生物多样性指数最低，为 1. 038。
这种根际微生物群落的差异可能是由不同盆景植物的根系分泌物差异所造成的，鸡爪槭、三角枫根际微生物群落相似可能是由于其系统发育地位较近( 槭树科槭属) 所造成的。而火棘( 蔷薇科) 根际微生物多样性较低可能是由于蔷薇科植物根系分泌物富含三萜酸类物质，对微生物具有抑制作用的原因。
0 引 言
盆景是以植物、山石等材料，经过艺术制作和园艺栽培，将自然界的优美景色集中、典型地在盆中进行塑造，是我国优秀的传统艺术之一［1］。目前对于盆景植物的研究多集中于栽培、造型和风格鉴赏等领域［2 － 3］，而关于盆景植物根际微生物生态学的研究只有少数报道［4］。
由于根际微生物在地上植物生长、养分吸收及抗性形成方面起着重要的反馈调控作用，因此研究盆景植物根际微生物的群落特征及变化趋势对于提高盆景养护水平，促进这一古老艺术形式的继承发展有着现实的意义。传统根际微生物学研究主要采用平板涂布、氯仿熏蒸等方法来测定土壤微生物生物量、基础呼吸和可培养微生物区系等［5 － 6］，而这些方法只能提供部分根际微生物功能、群落等信息，具有一定的局限性。
近年来分子生物学技术的广泛发展、应用，为根际微生物的研究提供了更为便利和清晰的方法手段。聚合酶链 式 反应 － 变性梯 度 凝 胶 电 泳 ( PolymeraseChain Ｒeaction － Denaturing gradient gel electrophore-sis，PCＲ － DGGE) 技术是基于核糖体 DNA 的保守序列设计出不同微生物类群的特异性引物，并通过相关的分子生物学测定技术研究其群落特征［7 － 8］。
本研究采用 PCＲ － DGGE 方法，对五种江西常见盆景植物: 三叶赤楠( Syzygium grijsii，桃金娘科蒲桃属，后文简写为 Sg) 、火棘( Pyracantha fortuneana，蔷薇科火棘属，Pf) 、三角枫 ( Acer buergerianum，槭树科槭属，Ab) 、鸡爪槭( Acer palmatum，槭树科槭 属，Ap ) 、金 边 瑞 香 ( Daphne odora， 瑞 香 科Thymelaeaceae 瑞香属 Daphne Linn． 植物，Do) 的根际微生物特征进行研究，这 5 种植物在生长习性，根系结构及根系分泌物组成方面均有很大的区别。观察盆栽条件下这几种江西特色盆景树种根际微生物的差异与变化，希望能从根际微生物调控方面找到一些改善盆景树种生长、提高观赏价值的新途径。
1 材料与方法
1. 1 样品采集与处理
供试植物为江西农业大学花卉盆景教学基地栽培的三叶赤楠、火棘、鸡爪槭、三角枫和金边瑞香盆桩，树龄 30 ～ 50a 不等，但上盆栽培时间均为5a，且每树种所取个体树龄相仿。各品种盆桩管理方式一致，施用肥料以充分发酵的饼肥为主，施用量一致。
按照刘玮等［4］的方法，每树种取三株个体的根际土壤混合，拣去植物残体，在田间含水量条件下过 2mm 筛，在 － 20℃ 条件下冷冻保存，以备后续 DNA 提取及相关分子生物学分析使用。
1. 2 土壤 DNA 提取及 PCＲ 扩增
盆景植物由于其养护方式，土壤多呈褐色及棕色，腐殖质类物质含量较高，而土壤中较多的腐殖质对于后续的 PCＲ 反应具有抑制作用，因此本试验土壤样品在提取 DNA 前要先进行脱腐洗涤［4］，洗涤后的土壤样品 DNA 采用 Fast DNA Spin Kit forSoil( Bio 101，Carlsbad，CA，USA) 试剂盒按照说明书从 0. 5 g 土壤样品中进行提取。提取后的土壤DNA 采用 Nano Drop ND － 8000 ( Nano Drop， Wilm-ington，USA) 微量分光光度计进行浓度及质量测定。在本试验中，采用细菌特异性引物 GC － 338F和 518Ｒ 进行 PCＲ 扩增［9］，目标 DNA 片段长度约为 340 bp。PCＲ 反应体系及条件按照刘有胜等［10］以及刘玮等［4］的方法并加以改进。PCＲ 反应产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测后具有明显目标条带的 PCＲ 产物用 QIAquick PCＲ 产物纯化试剂盒( TIANGEN，Beijing，China) 纯化后保存于－ 20℃ 待用。
1. 3 聚合酶链式反应 － 变性梯度凝胶电泳分析( PCＲ － DGGE)
采用美国伯乐( Bio － Ｒad) 公司的 DcodeTM的基因突变检测系统对不同盆景植物根际土壤 PCＲ 反应产物在 1 × TAE 的电泳缓冲液中进行电泳分离，凝胶变性梯度为 30% ～ 65% ，电泳温度为 60℃，电压 130 V 电泳时间 12 h。电泳结束后用 SYBＲGreenⅠ 核酸染料染色 30 min，在清水中退染 20min，然后用 Bio － Ｒad Gel Doc2000 凝胶成像系统观察结果并拍照。采用 Quantity One 2. 0( Bio － rad，USA) 软件对根际土壤微生物群落的 PCＲ － DGGE图谱进行分析，在去除背景噪音后检测不同样品电泳条带的数量和亮度峰值，通过图像分析软件分析凝胶图像数字化后 16S rＲNA 基因的指纹图谱。
1. 4 数据分析及统计
本研究中，根际土壤细菌群落的物种丰富度( S) 、Shannon － Weiner 多样性指数( H) 以及均匀度指数( E) 用来表征样品中细菌类群的多样性状况［11］。物种丰富度 S 以 DGGE 谱图中有效条带的数量( 经过校正) ，均匀度指数 E 表征不同样品根际土壤群落中条带的均匀度情况，即各细菌类群之间的分配情况。
排序分析及假设检验都用 CANOCO for windowsv． 4. 5 软件完成［12］，数据在进行 PCA 分析时没有进行转换。
2 试验结果
2. 1 不同盆景植物根际微生物群落 PCＲ － DGGE分析结果
经过脱腐洗涤后，减少了胞外 DNA 和腐殖质类物质的污染与干扰，土壤 DNA 的提取效果较好，所提取的土壤 DNA 条带明亮、清晰，经纯化后可直接用于 PCＲ 扩增。PCＲ 扩增产物片段长度约为340 bp，无引物二聚体和非特异性扩增。变性梯度凝胶电泳图谱分析表明，PCＲ － DGGE 方法对于盆景树种的根际细菌类群具有很高的分辨率，不同盆景树种根际土壤 DNA 样品经 DGGE 电泳后分离出不同数量、强度和位置的条带，代表着具有不同16S r DNA 序列解链特性的细菌类群［13］，条带越多证明细菌类群越多。经过变性梯度凝胶电泳，鸡爪槭样品分离出的条带数最多，为 26 条; 其次是三角枫和金边瑞香，为 19 条; 火棘样品和三叶赤楠样品的条带数较少，只有 3 条和 5 条。不同盆景植物样品根际土壤 DNA 的电泳条带强度及迁移率也存在一定程度差异，表明树种差异是造成盆景植物根际细菌群落种群变化的主要原因。
主 成 分 分 析 ( Principal Component Analysis，PCA) 被用来描述不同盆景植物土壤样品中细菌类群的分布特征( 如图 1 所示) ，PCA 分析结果表明盆景植物种类对土壤细菌群落具有显著的影响，不同盆景植物根际土壤细菌群落出现了明显的位置分化，在横轴上主要是由槭属的鸡爪槭、三角枫和桃金娘科的三叶赤楠、蔷薇科的火棘根际微生物差异所导致，而在纵轴上的差异则主要由瑞香科的金边瑞香构成: 在三叶赤楠( Sg) 和火棘( Pf) 周围土壤细菌条带很少，说明这些植物根际土壤中微生物的类群相对较少; 鸡爪槭( Ap) 和三角枫( Ab) 距离相对较近，在它们周围的条带也相近，如 6、7、8、9、11、13、15、16、21、25、29、30，说明这两种盆景植物的根际微生物类群组成较为接近，相同的微生物类群较多。
金边瑞香( Do) 的根际土壤微生物类群与其他盆景植有很大区别。说明不同盆景植物根际微生物组成有很大的差异，基本可以分为三部分，其中 Ap 和 Ab 根际微生物类群组成较为相近，Sg 和 Pf 根际微生物类群很少，而 Do 的组成与这两部分也有很大差异。
2. 2 盆景植物对根际土壤微生物群落丰富度及多样性特征影响
盆景植物种类对根际土壤细菌群落多样性特征的影响不同( 见表 1) : 不同盆景植物根际土壤细菌群落的丰富度及多样性特征发生了明显变化，鸡爪槭( Ap) 的物种丰富度及多样性指数最高，分别为26 和 3. 121; 三角枫( Ab) 和金边瑞香( Do) 的物种丰富度及多样性指数数值接近次之，分别为 19( Ab) 、19( Do) 和 2. 876( Ab) 、2. 873( Do) ; 火棘( Pf) 的物种丰富度和多样性指数最低，只有 3 和1. 038。
3 讨 论
以往对于盆景植物的研究多着重于造型修剪以及栽培技术，关于栽培生理方面的研究极少，而对于盆景植物根际微生态的研究几乎没有。根际微生物是植物 － 土壤微生态系统的重要组成部分，在植物养分循环过程中起着重要的作用［14 － 15］。因此通过根际微生物的研究可以了解盆景植物 － 土壤微生态系统的协同关系，为盆景植物的高效培育提供依据［16］。
物种多样性是指群落中物种数目的多少，它是衡量群落规模和重要性的基础。种类越多，各种个体数量分布 越均 匀，物 种 多 样 性 指 数 越 大。在DGGE 图谱中，每一个 DGGE 条带代表的并不是一种微生物，而是一类微生物［17］。本研究被分离的每一个条带代表样品微生物群落中的一个细菌类群，条带的深浅则代表了这种细菌类群的多少和丰富程度［18］。不同植物类型对于根际微生物类群影响也 不 相 同，鸡 爪 槭 的 多 样 性 指 数 最 高， 为3. 121; 三 角 枫 和 金 边 瑞 香 次 之， 为 2. 876 和2. 873; 火棘的多样性指数最低， 只有 1. 038 ( 表1) 。鸡爪槭样品条带数最多，为 26 条; 其次是三角枫和金边瑞香，为 19 条; 火棘样品的条带数最少，为 3 条。供试样品间具有许多共同的条带，说明不同植物间存在一些共有的微生物类型。这些公共条带的强度也各不相同，表明不同植物间相同微生物类群在数量水平上也有区别。不同盆景植物的根际微生物类群及数量不同，有可能是受植物凋落物分解及植物根际分泌物的影响。
在之前的一些研究中发现在盆栽试验中混入土壤的凋落物对于根际微生物的群落结构产生了显著影响［19］。但是由于盆景植物的特殊养护手段，凋落物几乎不会在土表存留，因此对盆景植物根际微生物群落来说，根系分泌物的种类和数量可能影响更大，并可能对根际微生物的生长繁殖及代谢过程产生影响［219。例如有研究表明茄科植物番茄的根际分泌物对丛枝菌根真菌 Gigaspora gigantean 和 Gigaspora intraradices 的菌丝生长有很大的影响［20］。根系分泌物不但对微生物的生物量产生积极作用，并且对微生物群落的构成产生重要影响。例如随着小麦( Triticum aesti-vum) 生长过程中根系分泌物的增加，根际环境中反硝化细菌的数量明显增加［21］，另外小麦根系分泌物中的酚酸还具有抗菌性，对于根际微生物还具有一定的筛选作用［22］。
根际微生物群落物种丰富度及多样性指数最高的鸡爪槭( Ap，26 和 3. 121) 、三角枫( Ab，19 和2. 876) 都是槭树科槭属植物，而最少的火棘( Pf，3和 1. 038) 是蔷薇科火棘属植物，因此不同植物种属间根系分泌物的差异可能是造成根际微生物群落差异的原因，相近种属植物间根际微生物相似性较高。有研究对蔷薇科 4 种灌木: Adenostomci sparsi-folium ( 下 文 简 称 As ) 、 Cowania mexicana var．glaber ( Com ) 、 Cercocarpus montanus var． glaber( Cem) 、Fallugia paradoxa( Fp) 的根系分泌物进行研究发现它们共同的主要分泌物为三萜酸类而它们之间又各自有一些差异: 其中 As 和 Com 的分泌物主要为黄酮苷，As 还分泌齐墩果酸; Cem 和 Fp 的分泌物主要为类黄酮化合物［23］。有研究表明冬青科植物细叶冬青( Ilex integra) 中的三萜酸类化合物对细菌和真菌具有抑制作用［24］。
火棘的根际微生物的生物类群少的特性可能和三萜酸的分布有关。鸡爪槭和三角枫为亲缘关系较近的树种，它们之间的根际分泌物在某种程度上，具有一定的相似性，这也导致二者之间的根际微生物相度较高。
根际微生物群落的动态变化也对根际生态系统的物质循环和能量流动产生着反馈作用，从而影响植物的生长发育及植被多样性变化［25］。
不同的盆景树种，其地上的生长和地下微生物之间存在着不同的互动规律，有研究表明三叶赤楠随着栽培时间的增加，土壤微生物多样性增加，在第 4 年时其地下微生物多样性最高，在第 8 年时又有所降低，这就能为三叶赤楠养护期间的换盆时间提供更多的依据［4］。
更多的盆景植物的地上部分和地下微生物之间互动的关系和规律还有待进一步的探索。如果能够充分了解其规律，且对盆景植物的栽培管理时能把其地下微生物的情况纳入到考虑的因素之中，则能够使植物的生长更加健壮，使其观赏效果大大提高，达到事半功倍的效果。