摘要：目的：建立一种可测定佛手饮片中橙皮苷含量的RP－HPLC方法。方法：采用Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱；流动相为甲醇一1.5％磷酸溶液(50:50)；检测波长为284nm；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；峰面积外标法定量；结果：本法橙皮苷在64.26～963.6μg/mL范围内呈良好的线性关系，(r=0.9998)，平均回收率为95.33％，RSD 1.73％。结论：本方法简便、快速、准确可靠，可作为该中药饮片的质控方法。
　　关键词：佛手；饮片；高效液相色谱法；橙皮苷；含量测定
　　中图分类号：R285.5　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-1036-02
　　
　　佛手为芸香科植物佛手(Citrus medica L var.sarcodacylis Swingle)的干燥果实。为常用中药，味辛、苦、酸，性温，归肝、脾、肺经。具有舒肝理气、和胃止痛的功效，用于肝胃气滞，胸胁胀痛，胃脘痞满，食少呕吐等症。《中国药典》2005年版一部对佛手仅设置了显微鉴别和薄层色谱鉴别，没有含量测定，因橙皮苷为佛手中的主要有效成分，所以笔者采用高效液相色谱法测定其中的橙皮苷含量，结果准确，操作方便，可用于该药的质量控制。经方法学研究，证明本法可行。现报道如下。
　　
　　1仪器与试药
　　
　　1.1仪器　日本岛津LC-2010 A高效液相色谱仪，自动进样系统；Lcsolution Version 1.11 SP1色谱数据工作站；日本岛津UV-2450紫外分光光度计；KQ-250B型超声波清洗器(功率：250W,频率：40kHz。昆山市超声仪器有限公司)。
　　1.2试药　甲醇为色谱纯；磷酸(分析纯)；水为重蒸馏水；橙皮苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：0721-200010(供含量测定用)。佛手饮片(市售批号：041110、050323、050112、050317、050328、050319、050222)，均经本所富同义副主任中药师鉴定。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1色谱条件和系统适应性实验 色谱柱：Shim-packVP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-1.5％磷酸溶液(50:50)；检测波长为284nm；流速：1.0mL/min，柱温：40℃；进样量：5μL；面积外标法定量。理论塔板数按橙皮苷峰计算不应低于4000。分离度大于1.5，对称因子在0.95～1.05之间。
　　2.2对照品溶液的制备　精密称取用五氧化二磷减压干燥24h的橙皮苷对照品10.71mg，置50mL量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取3mL,置10mL量瓶中，加人甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每mL含橙皮苷64.26μg的对照品溶液。
　　2.3供试品溶液制备　取佛手饮片适量，60℃烘干，粉碎，过3号筛，精密称取约1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
　　2.4标准曲线的制备　分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0,4.0、5.0、8.0、10、15μL，注入高效液相色谱仪，按上述条件测定，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、橙皮苷进样量(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=4.170×102X+1.811×106，r=0.9998。结果表明橙皮苷的溶液在64.26～963.6μg mL之间呈良好的线性关系。
　　2.5精密度试验　按上述色谱条件，取同一批样品溶液(批号：050222)，进样5μL，重复进样5次，结果：橙皮苷峰面积基本不变，BSD为0.74％；再取同一批橙皮苷对照品溶液，进样5μL，重复进样5次，结果：橙皮苷峰面积也基本不变，RSD为0.51％，说明仪器性能良好。
　　2.6重现性试验　取同一批号样品6份(批号：050222)，照2.3项下操作，分别按上述色谱条件测定，结果RSD为1.94％(n=6)。说明方法重现性良好。
　　2.7稳定性试验　取同一批号样品溶液(批号：050222)，在常温下放置12h，每间隔2h测定1次，连续共测定6次，结果：橙皮苷峰面积RSD为1.56％。表明样品溶液的稳定性良好。
　　2.8回收率试验　采用加样回收试验方法，取已知橙皮苷含量(批号：050222，橙皮苷含量为0.4310mg/g)的样品粉末9份，每份约1.0g，精密称定，分别加入一定量对照品(加入量分为3个浓度：低、中、高)，照2.3项下操作，分别按上述色谱条件测定。
　　2.9样品测定　取样品适量，照2.3项下操作制备得样品溶液。另取橙皮苷对照品适量，照2.2项下操作制备得对照品溶液。按上述色谱条件进样5μL，记录橙皮苷蜂面积，按外标法计算含量。
　　
　　3讨论
　　
　　3.1检测波长的选择　取上述橙皮苷对照品溶液，用日本岛津UV-2450紫外分光光度计在波长200-400nm处扫描，结果在284nm波长处有最大吸收，故以284nm为检测波长。
　　3.2样品的提取　笔者曾用甲醇，分别超声提取10、20、30、45、60min后进样测定峰面积比较，结果超声处理30min以后橙皮苷峰面积基本不变，故选用超声处理30min。
　　3.3柱温的选择　柱温虽对组分的分离度影响较小，但对样品组分的保留时间(tR值)影响较大，经反复试验：柱温在40℃时既可加快分析速度，又可保持出峰时间的恒定，从而保证试验结果的重复性和准确性。
　　3.4流动相的确定　笔者比较了甲醇-水(25:75)、乙腈-1.5％磷酸(15:85)、甲醇-1.5％磷酸(50:50)等3种流动相，结果以甲醇-1.5％磷酸(50:50)分离效果最好，故选用此为流动相。然后又对甲醇与不同浓度的磷酸溶液配比对峰形的影响进了考察，实验结果表明随磷酸浓度的增加，峰形进一步变尖锐。但考虑到酸度对色谱柱的影响(要求流动相pH应大于2.0)，流动相pH值不宜过低，故选用此比例，此时流动相的pn为2.2左右。
　　3.5实验补充说明 佛手饮片在空气中容易吸潮，不易粉碎，且影响结果，考虑到佛手含有挥发油等挥发性成分，故样品采用60℃烘干，粉碎，过3号筛(使粉末均匀)等处理。取样及含量计算均以此干燥品为准。另外，不同产地(本文收集到的佛手饮片均标示产地广东)、不同贮藏时间(本文中只收集到2004年和2006年2年的批号，且大部分为2005年)是否对橙皮苷的含量有影响，还有待于进一步考察。
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。