铁皮石斛与金钗石斛F1代杂种鉴定：基于SRAP与SSR分子标记技术的真实性分析
摘要：为了鉴定铁皮石斛和金钗石斛杂交F1代杂种的真实性，运用SRAP和SSR分子标记鉴定F1代。结果表明，从20对SRAP引物和10对SSR引物中各选出1对用于22株F1代鉴定，鉴定结果为21株是真杂交种，真杂交种率为95.4%。由此可知，用SSR和SRAP标记鉴定石斛杂交后代可行，对加快石斛育种的速度，缩短育种的时间年限和石斛的种质资源保护具有重要意义。
关键词：铁皮石斛；金钗石斛；F1代；SRAP；SSR；杂种鉴定
石斛属植物历史悠久，《神农本草经》中就有记载[1]。石斛属植物具有极强的药用性，近年来也常作园林观赏植物[2]。据统计，在我国有接近50种石斛品种的茎秆被用于中药，根据相关研究，石斛茎中含生物碱、多糖、倍半萜和芳香化合物等有效成分[3]，现有研究表明，石斛多糖可用作抗肿瘤药物[4]、抗氧化剂[5]、免疫抑制剂和抗病毒药物[6]。
铁皮石斛和金钗石斛在近年来的石斛市场上深受喜爱，两者均被《中华人民共和国药典（2020版）》收录，兼具药用性和观赏性，经济价值极高，导致野生石斛被过度采挖，由于野生石斛自然繁殖率较低，野生石斛资源逐渐枯竭。应加强对石斛兰育种技术的研究，保护发展石斛，扩大石斛产业[7]。在石斛的遗传与育种研究中，杂交获得双亲的优良性状是基础，但部分石斛可能存在自花授粉的情况，所以对其进行杂种鉴定，筛选出假杂交种并去除是必要的。
近年来，DNA分子标记技术被大量运用于石斛遗传关系的研究中，包括SRAP、ISSR、RAPD、SSR等分子标记技术[8-10]。在石斛的遗传研究中，简单重复序列标记和相关序列扩增多态性被开发及应用得越来越多[11-12]。SRAP标记具有简便、高效、易测序、重复性好等特点，SRAP标记已广泛被用于植物的遗传分析和遗传图谱构建[13]。SSR标记在植物的杂种鉴定和遗传图谱构建方面常被使用，因其重复性好、多态性高、呈共显性的特点[14]，已被用于铁皮石斛和金钗石斛的杂交鉴定中，但尚未见SRAP标记用作其的鉴定。本研究以铁皮石斛为母本、金钗石斛为父本杂交得到的F1代杂交种为试验材料，运用SRAP和SSR分子标记技术对其进行真假杂交种鉴定，可缩短石斛属植物杂交育种时间，还可为石斛属植物的遗传研究奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以铁皮石斛为母本、金钗石斛为父本，杂交得到F1代为试验材料。试验材料均来自与西华师范大学生命科学学院。
1.2 试验方法
采用改良CTAB法提取叶片DNA[15]，随机抽取22株杂交F1，代编号为（1~22），取其0.1g嫩叶用作DNA提取，父本母本也并各取其0.1g嫩叶用作DNA提取，使用1%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，使用分光光度计检测其浓度，将DNA样品浓度稀释到25ng/ul，置于-20℃冰箱中保存备用。
1.2.1 引物获得
选取20对SRAP引物和10对SSR引物[16-18]，以上引物均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。
1.2.2 SRAP、SSR引物的筛选
以铁皮石斛为母本、金钗石斛为父本杂交得到的F1代杂交种DNA和亲本DNA为模板，对引物进行筛选，筛选出条带清晰、亲本间无同一位点的SSR引物和SRAP引物，用于后续F1代杂种真实性的鉴定。
1.2.3 SRAP、SSR反应体系、PCR扩增程序及电泳检测
SRAP-PCR反应体系[16]为总体积25uL，模板DNA30ng，Mg2+2.0mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，引物0.4μmol/L，rTaqDNA酶1.0U，10×PCRbuffer2.5μL，加ddH2O补齐25μL反应体系。
（1）SSR反应体系[17]为总体积15μL，模板DNA20ng，Mg2+1.5mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，引物0.4μmol/L，rTaqDNA酶1.2U，2μL10×PCRbuffer，加ddH2O至15μL反应体系。
（2）SRAP-PCR扩增程序见图1。
（3）SSR-PCR扩增程序见图2。
（4）PCR扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳（120V，90min），并在2L0.1%AgNO3溶液中染色，最后放入2L显色液中显色（40gNaOH+0.8g无水碳酸钠+8mL甲醛+2LddH2O）直到出现清晰条带，拍照记录。
1.3 数据分析
通过电泳条带可以将F1代分为4种类型。具有父本条带的不具有母本条带的为父本型；具有母本条带不具有父本条带的为母本型；同时具有父母本条带的为真杂交种型；不具有父母本条带的为缺失型。具有父本条带和父母本条带的后代为真杂交种型。
2 结果与分析
2.1 DNA检测
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测石斛DNA纯度，用1μLDNA溶液和4μL6×上样缓冲液充分融合，120V电泳30min检测，标准分子量使用天根D2000DNAMarker（上海金畔生物科技有限公司）。OD260/OD280在1.80~2.00，无RNA和蛋白质污染，DNA纯度满足SRAP分子标记和SSR分子标记对DNA的质量要求，部分电泳结果见图3。
2.2 SRAP和SSR引物筛选结果
从20对SRAP引物中和10对SSR引物中筛选出SRAP08和SSRDM193（见表1），用来鉴定F1代中的真杂种。从扩增结果看，引物SRAP08在100bp处母本和父本各具有1个条带（见图4），引物SSRDM193在250~100bp母本和父本具有1对清晰的条带（见图5）。
2.3 石斛杂交群体SRAP和SSR鉴定结果
引物SRAP08鉴定结果显示（见图6），在22个杂交后代中1、2、3、4、7、8、9、10、11、13、14、15、16、18、19、21同时具有父本和母本的条带为真杂交种，5、6、22只具有母本条带为母本型；12、17、20为缺失型。剩余6株无法辨别真假杂交种需要用引物SSRDM193继续鉴定，结果显示（见图7），22个杂交后代中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22同时具有父本和母本的条带为真杂交种，真杂交种率在95.4%；后代12在引物SRAP08的鉴定下不具备条带，在SSRDM193的鉴定下只具备母本带，因此可以确定子代12为假杂种。
结合引物SRAP08和引物SSRDM193的分析结果，从F1代中的22个子代单株中鉴定出21个子代单株为真杂交种，真杂交种率为95.4%。所以，石斛杂交群体利用SRAP和SSR标记鉴定其杂种真实性是有效的。有的F1代单株中存在父母本中未出现的条带，可能是在减数分裂中的同源染色体重新配对交换或者发生了基因突变[19]。
3 结论与讨论
杂交育种是石斛新品种培育的一种主要方式，但石斛种类丰富且遗传背景复杂[20]。常规的杂交育种周期长，而且少数石斛可能存在自花授粉的情况，所以，对其进行真假杂交种的筛选，去除其中的假杂交种是必要的，可减少育种的时间成本和金钱成本。在生产中鉴定植物杂交后代的方法多为形态鉴定法[21]，但该方法时间长、效率低、易受环境影响，鉴定准确性低。
DNA分子标记技术是在DNA显示出亲本和子代的遗传差异，检测快速、准确。SRAP标记和SSR标记已用于多种植物研究，智丽等[22]用19对SRAP引物分析了23种百合的遗传关系；许娜丽等[23]利用SRAP和SSR标记小麦品种资源遗传多样性及农艺品质性状分析；董佳琦等[24]运用SRAP分子标记鉴定扁蓿豆杂交后代；张冰清等[25]利用SSR标记进行杂交油菜品种鉴定。以上结果表明，SRAP分子标记和SSR分子标记可用于杂交种的遗传分析。夏玲等[26]用5对SRAP引物鉴定出西番莲F1代100%的单株为真杂交种，张婧等[27]用1对SSR引物鉴定出柳枝稷F1代所有单株均为真杂交种；谢文刚等[19]用3对SSR引物鉴定出鸭茅F1代111个单株为真杂交种，真杂交种率为79.29%，均与本研究研究结果相似。
在本研究中，选取20对SRAP引物和10对SSR引物，对以铁皮石斛为母本、金钗石斛为父本杂交得到的F1代杂交种进行扩增，筛选出1对SRAP引物和1对SSR引物能对石斛后代群体进行鉴定，SRAP标记从22个后代单株中鉴定出16个后代为真杂交种，SSR标记从22个后代单株中鉴定出21个后代为真杂交种，2种引物共鉴定出21个后代为真杂交种，真杂交种率达到95.4%。表明了SRAP分子标记和SSR分子标记可用于石斛后代的真假杂交种的鉴定，通过多引物重复鉴定可提高鉴定准确性，加速了石斛新品种的选育速度，为后续继续开展研究打下基础。
