甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果及定殖能力

 

 

摘要：为了探明甲基营养型芽胞杆菌AL7对棉花黄萎病的防治效果及其定殖能力，本文利用盆栽接种试验研究了菌株AL7对棉花黄萎病的防治效果；将带四环素抗性的pGFP78质粒转入到菌株AL7中，分析了菌株AL7在棉花根围土壤中、根部组织内的定殖情况。

 

结果表明，菌株AL7对棉花黄萎病的盆栽防治效果为77.1%。pGFP78质粒转入后对菌株AL7的生长没有明显影响，仍具有游动性和产生物膜。定殖检测结果表明，菌株AL7能够在棉花根围土壤中及根系组织内长期定殖，接种5d时定殖数量最高，达6×106cfu/g土，接种80d后根围土壤中的定殖数量仍维持在2×106cfu/g，根系组织内的定殖量为6×104cfu/g。利用激光共聚焦显微镜观察验证，接种7d后菌株AL7已经进入到棉花根部的中柱鞘细胞，能够在棉花根内大量定殖。

 

棉花黄萎病为系统性侵染的土传病害，对棉花生产危害很大，其病原菌大丽轮枝菌VerticilliumdahliaeKleb.致病力分化严重，变异速度快[1]，防治十分困难。随着对环境安全问题更为重视，生物防治被认为是治理棉花黄萎病最具发展潜力的方法[2]，对生态环境友好的生物菌剂开发、利用得以深入研究。但是，生产上应用生防菌剂防治棉花黄萎病存在防效不稳定、效果不佳的问题，生防菌受到土壤中土著微生物的竞争作用、生防菌与植物根部亲和能力以及其他非生物因子的影响是重要原因[3,4]。

 

生防菌能否在土壤中或作物体内有效定殖是其充分发挥作用的前提[5-7]，对生防菌在土壤中或植株内的定殖规律进行系统深入研究，不仅为揭示生防菌的生防作用机理及与植物的互作机制提供支持，也为提高生防菌对棉花黄萎病的防治效果提供解决途径，对于减轻棉花黄萎病的危害有重要的意义[8]，同时为生防菌资源的开发利用提供依据。

 

甲基营养型芽胞杆菌BacillusmethylotrophicusAL7是一株对大丽轮枝菌、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、白粉菌Sphaerothecafuliginea等多种病原菌具有极强拮抗效果的生防菌，开发应用潜力大。但是，关于该菌株对棉花黄萎病的盆栽防治效果及其在土壤、棉花根内的定殖能力并不了解。因此，本试验将带四环素抗性标记的pGFP78质粒转化到菌株AL7中，利用抗性平板法结合激光共聚焦显微镜技术[9-15]研究该生防菌株在土壤及棉花根部组织内的定殖能力，为该菌株的进一步开发应用提供理论依据。

 

1材料与方法

 

1.1试验材料

 

1.1.1供试菌株和质粒

 

菌株AL7是新疆棉田土壤中分离获得的一株具有广谱抑菌活性的生防菌株，经鉴定为甲基营养型芽胞杆菌；本实验室保存的大肠杆菌EscherichiacoliDH5α和构建的pGFP78质粒，其中带有四环素（tetracycline，Tet）抗性基因和gfp基因。

 

1.1.2供试培养基、试剂及仪器

 

细菌培养采用LB培养基；四环素购自北京鼎国生物公司，使用浓度为10μg/mL；电击转化用Bio?rad电击仪；供试仪器还包括LeicaSP8激光共聚焦显微镜等。

 

1.2菌株AL7对病原真菌的拮抗能力测定

 

采用对峙培养法测定菌株AL7对不同病原真菌的拮抗能力。用灭菌的接种针在培养好的病原菌菌落边缘挑取约0.5cm×0.5cm菌块接入PDA平板中心。在距PDA平板中心30mm处利用灭菌牙签点接或划线接种菌株AL7，以仅接种病原菌菌饼的平板作为对照，待对照组病原菌长满平板时测量菌株AL7对病原菌的抑菌带宽度，抑菌带宽度是指病原菌边缘至拮抗菌株边缘的最短距离，每处理3个重复。

 

1.3菌株AL7盆栽防治效果测定

 

待棉苗生长至两叶一心时采用伤根接种法接种大丽轮枝菌孢子悬浮液。试验设4个处理，①：空白处理（处理②对照）；②：每营养钵接种浓度为108cfu/mL的AL7菌液50mL；③：每营养钵同时接种浓度为108cfu/mL的AL7菌液和107cfu/mL的大丽轮枝菌孢子悬浮液各50mL；④：每营养钵接种浓度为107cfu/mL的大丽轮枝菌孢子悬浮液50mL（处理③对照）。

 

以上每个处理6个营养钵，每个营养钵10株棉苗，接种70d后，根据棉苗的发病情况，调查不同处理的病情指数，计算菌株AL7的盆栽防治效果。棉花黄萎病病情调查均按全国统一标准进行分级[16]。病情指数＝∑（各级病株数×相应级别）/（调查总株数×4）×100。

 

1.4菌株AL7游动性和生物膜检测

 

将活化好的菌株接种于装有5mLLB液体培养基的试管中，于摇床37℃、200r/min摇培8h。用移液枪吸取2μL细菌摇培液，接种于0.7%琼脂浓度的LB固体培养基平板中央，封口膜封口，放置于水平桌面上，室温培养，观察菌株的游动情况，每个处理3个重复。

 

将同样按照上述方法培养的菌株按1:1000的比例用新鲜的LB液体培养基稀释，取1mL菌液转移到新的1.5mL的无菌离心管中，培养3d后，加入200μL0.1%（W/V）结晶紫染色15min[17]，利用清水慢慢冲洗（滴加），观察管口紫色膜状物形成情况。

 

1.5.1芽胞杆菌感受态的制备

 

挑取LB平板上活化的菌株AL7单菌落于装有5mLLB液体培养基的试管中，于摇床中30℃、160r/min振荡培养8h；取1.5mL过夜摇培液加入40mLLB液体培养基，37℃、200r/min摇培，用分光光度计测定菌液OD（OD600）值；待菌株生长到OD600值为0.5左右时，加入弱化剂（2%甘氨酸和4%DL?苏氨酸），继续摇培，每10min测一次菌悬液OD600值，待OD600值开始下降时，将菌悬液转入50mL离心管中，配平后转移至冰上，冰浴10min；将预冷的菌液于4℃、8000r/min离心10min，弃上清，菌体用1mL电击缓冲液重悬混匀后，吸入2mL离心管中，4℃、8000r/min离心5min，倒掉上清，重复离心5次。

 

加200μL电击缓冲液，轻轻吸打，混匀后分装于1.5mL离心管中备用。1.5.2芽胞杆菌的电击转化吸取5μL待转化质粒pGFP78于制备好的甲基营养型芽胞杆菌AL7感受态中，吸打混匀后，全部加入0.2cm电极杯中（电击杯在冰中预冷），电击电压为1.8kV，电击一次（整个操作在冰上进行）。电击完成后，立即吸取900μL复苏培养基于电极杯中，吸打混匀，转入1.5mL离心管（37℃预热），37℃、160r/min摇培3h。吸取200μL摇培液涂布于含四环素（TetR，10μg/mL）的LB平板上，放于37℃培养箱中培养，直至长出菌落，需进行验证。

 

1.5.3标记菌株的筛选和验证

 

挑取抗性平板上长出的菌落重新在LB抗性平板（TetR，10μg/mL）上划线，传代培养3代后，挑取单菌落于荧光显微镜下观察荧光，并提取质粒，PCR扩增gfp基因，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物大小，验证转化是否成功。