碱胁迫下杜鹃花抗氧化体系的响应及亚细胞分布 

 

摘  要：为探讨杜鹃花属（Rhododendron）植物的耐碱性机理，以 3 个杜鹃花园艺栽培品种‘胭脂蜜’（R. obtusum‘Yanzhimi’）、‘红珊瑚’（R. obtusum‘Hongshanhu’）及‘红月’（R. obtusum‘Hongyue’）为试验材料，对植株进行为期 2 个月的 Na HCO3和 Na2CO3混合碱胁迫处理，观察植株在碱胁迫下的形态变化并测定叶片叶绿体、线粒体和细胞溶质 3 个亚细胞部位中活性氧及抗氧化体系的活性。结果表明：根据碱害指数，3 个杜鹃花品种耐碱性从高到低依次为‘胭脂蜜’>‘红珊瑚’>‘红月’。

在碱胁迫下，3个品种的 3 个亚细胞部位中 H2O2和超氧阴离子水平显著提高，导致 MDA 含量增加，抗氧化酶的变化存在品种间差异。‘胭脂蜜’的 3 个亚细胞部位中 SOD、POD、CAT 和 GR 酶活性显著提高，APX 在叶绿体和细胞溶质中的活性显著上升；而‘红珊瑚’仅叶绿体中的 CAT 和 APX、线粒体中的 SOD、POD 和CAT 以及细胞溶质中的 SOD、GR 活性显著提高；‘红月’的 SOD 活性在线粒体和细胞溶质中显著提高，CAT 活性在叶绿体和线粒体中显著提高，POD 及 APX 活性显著下降，GR 活性无显著变化。碱胁迫下，3 个品种的非酶促抗氧化剂 As A 和 GSH 含量在叶绿体中降低，在线粒体和细胞溶质中增加。抗碱性强的‘胭脂蜜’在碱胁迫后 ROS 水平较稳定，MDA 含量较低，SOD、POD、APX 和 GR 活性较高。

3 个亚细胞部位比较发现，细胞溶质中 H2O2和超氧阴离子的水平显著高于线粒体和叶绿体，抗氧化酶 SOD、POD和 GR 及抗氧化剂 As A 和 GSH 也主要分布在细胞溶质中，活性氧与抗氧化系统的亚细胞分布具有较高的一致性；APX 主要分布在叶绿体中；CAT 在线粒体活性最高。碱胁迫下不同亚细胞部位活性氧积累和过氧化损伤程度不同，相应的抗氧化防御体系在各亚细胞的响应也不同，细胞溶质是杜鹃花活性氧产生和清除的主要场所。 

 

杜鹃花属（Rhododendron）植物喜酸性疏松的土壤，不耐盐碱，适宜 p H  4.0  ~  6.0，在 p H  7.0以上的土壤中生长不良（林斌，2008）。中国的盐碱地分布广泛，极大限制了野生杜鹃花的推广应用。 

 

研究表明植物的抗氧化体系与植物耐碱性相关（刘铎  等，2017；Hu et al.，2018）。在碱胁迫下，植物会产生大量活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（· OH）等，这些ROS 具有高度的活性和毒性，会对植物的亚细胞成分和新陈代谢产生不利影响（Tan et al.，2010；Hu et al.，2018），而抗氧化防御机制能减少这些 ROS 对细胞的损伤，超氧化物歧化酶（SOD）将超氧阴离子转化为 H2O2，H2O2经过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）及抗坏血酸—谷胱甘肽循环（As A–GSH 循环）最终转化为水（Apel & Hirt，2004）。

在各种非生物逆境胁迫下，活性氧及抗氧化物质在亚细胞部位的分布也不同。如低温胁迫下冬小麦（Triticum aestivum）叶片叶绿体中 H2O2含量及抗氧化酶 SOD、APX、CAT 活性均高于线粒体中的（Li et al.，2014）；短暂水分胁迫下玉米（Zea mays L.‘Nongda 108’）叶片 SOD、CAT、APX 活性及 As A、GSH 含量在细胞溶质中的分布高于叶绿体、线粒体、过氧化物酶体及质外体（Tan et al.，2010）。即使同一物种，其抗性不同，抗氧化物质的亚细胞分布也不同。

如盐胁迫下，番茄耐盐种［Lycopersicon  pennellii（Corr.）D’  Arcy accession Atico］中的 SOD、APX、GR 主要分布在叶绿体中，而盐敏感种（Lycopersicon esculentum Mill.‘M82’）APX 主要分布在叶绿体中，SOD 主要分布在线粒体和过氧化物酶体中，GR 主要分布在细胞溶质中（Mittova et al.，2000）。 

 

目前关于植物耐盐碱的研究主要集中在中性盐 Na Cl 的研究上，而对碱性盐的关注相对较少，对杜鹃花的研究则尚未见报道。Lv 等（2013）的研究表明，与中性盐相比，高 p H 值碱胁迫对植物生长危害更大，而中国的碱性盐地区又多以 Na2CO3和 Na HCO3为主。目前杜鹃花属植物抗氧化体系与干旱（李娟  等，2015）、高温（李小玲  等，2018）、低温（Wang et al.，2009；Zhou et al.，2017）等胁迫的相关性已有报道，但碱胁迫对其细胞溶质、线粒体、叶绿体中 ROS 产生和代谢的影响知之甚少。本研究中以 3 个杜鹃花品种为试验材料，分析碱胁迫下 3 个杜鹃花品种亚细胞部位中活性氧及抗氧化物质的变化，探讨其在亚细胞组分中的分布差异，有助于深入了解杜鹃花的耐碱机理。 

 

 

1   材料与方法 

 

1.1   试验材料及其处理 

 

试验材料为 3 个杜鹃品种‘胭脂蜜’（R.  obtusum‘Yanzhimi’）、‘红珊瑚’（R.  obtusum‘Hongshanhu’）和‘红月’（R. obtusum‘Hongyue’）的 1 年生扦插苗，苗高约 17 cm。 

 

栽培基质为泥炭和珍珠岩（3︰1 体积比）。试验在南京林业大学园艺实验教学中心园林植物实验室植物生长室内进行，温度（25 ± 2）℃，光照强度 165 μmol · m2 · s-1，光照时间 12 h · d-1，空气湿度 70% ~ 80%。碱处理浓度为 60 mmol · L-1（前期预试验使用 Na HCO3溶液 15、30、50、60 mmol · L-1处理，植株未出现显著症状，因此加入碱性更强的 Na2CO3混合处理，Na HCO3︰Na2CO3 = 5︰1）。



每盆 1 株苗，每处理 10 盆苗，处理液倒入喷壶中，用喷壶均匀喷洒栽培基质，直至盆底有少量溶液流出。2018 年 6 月 13 日开始碱处理，2 个月后，3 个杜鹃品种呈现不同程度的碱胁迫症状，有的品种有落叶产生。8 月 13 日取样，每处理取植株中部的功能叶 10 g（叶片取自同一部位），保存于–80  ℃冰箱。试验重复 3 次，每次试验材料 10 株，每个指标重复测定 3 次。 

 

采用干渣残法（杨剑虹  等，2008）进行栽培基质水溶性盐总量的测定。处理 0、10、20、30、40、50、60  d 取栽培基质进行总碱性盐含量的测定，对照基质为 0.16%。随着时间增长，土壤碱性盐含量增加，在 0.30% ~ 0.80%之间。 

 

1.2    形态碱害指数统计与生理指标测定 

 

在试验结束时统计碱害形态指标。碱害程度分为 5 级：0 级，无受害症状，1 级，叶片出现水渍斑点，边缘枯黄；2 级，叶片 1/3 枯黄；3 级，新生叶边缘卷曲，叶片 1/2 枯黄；4 级，新生叶边缘严重卷曲；叶片枯黄面积大于 1/2。碱害指数  = Σ（各级叶片数  ×  级数）/（最高级数  ×  总叶片数）× 100。 

 

参考于飞等（2014）的方法进行亚细胞部位的提取，全部操作在冰上进行。每处理各取 10 g 叶片，倒入适量液氮在研钵中迅速研磨，样品呈白色粉末状加入 30 m L 亚细胞提取缓冲液（0.05 mol · L-1 Tris-HCl，0.35 mmol · L-1山梨醇，2 mmol · L-1 EDTA 和 2.5 mmol · L-1 DTT，p H 7.5）混匀，经纱布过滤（4 次），滤液离心（500 × g，5 min，4  ℃），弃去沉淀，上清液于 2 000 × g 离心 10 min，沉淀为叶绿体部分，上清液部分再在 12 000 × g 离心 20 min，所得沉淀为线粒体部分，上清液即为细胞溶质部分。将所得的叶绿体和线粒体部分分别用亚细胞提取缓冲液洗涤 1 次，并分别在 2 000  ×  g 和12 000 × g 重复离心 1 次，取沉淀用 5 m L 提取缓冲液悬浮。 

 

1.5   数据处理与统计分析 

 

试验过程中的数据处理、相关性分析等均运用 Excel 2007 和 SPSS 19.0 软件完成，使用 SPSS19.0的最小显著差异法（LSD）法和邓肯氏新复极差法进行方差分析和显著性分析。