基于表型和SRAP标记的盆栽菊遗传多样性分析

 

摘要：基于20个表型性状和相关序列扩增多态性（标记技术对30个国外引进盆栽菊品种遗传多样性进行研究。结果表明，参试盆栽菊品种表型变异丰富，性状变异系数为14.67%~78.25%，最低和最高变异系数分别为冠幅和舌状小花数。性状主成分分析结果显示，前5个主成分贡献率达76.68%，综合反映了花型大小、叶片形态和花色的重要性。基于表型性状的聚类分析可将30个盆栽菊品种划为3个类群：第Ⅰ类群包含14个品种；第Ⅱ类群包含2个品种；第Ⅲ类群包含14个品种。表型性状的聚类结果与花径和观花期有一定联系。

SRAP分析筛选到11对多态性引物，获得1866个多态性位点，多态性比例为92.61%。品种间的遗传相似系数为0.67~0.85，表明30个品种存在一定的遗传变异。基于品种间遗传距离构建的NJ进化树结果显示，30个盆栽菊品种可划分为3个类群：第Ⅰ类群包含2个亚群，共17个品种；第Ⅱ类群包含10个品种；第Ⅲ类群包含3个品种。2种分类方法均将研究对象分为3个类群，但这3个类群的品种组成并不一致，推测可能和菊花材料本身复杂的遗传背景与试验选材的局限性有关。

 

菊花（Chrysanthemum×morifoliumRamat.）起源于中国，花型、花色和株型等千姿百态，品种资源异常丰富。据报道，全世界菊花品种约有20000~30000种，中国约有3000多种[1]。栽培菊花大多为六倍体（2n=6x=54）或非整倍体，基因组高度杂合且十分庞大（约12.381~24.802Gb），遗传背景非常复杂[2]。菊花种质资源的鉴定、保存和评价是生产利用和选育菊花新品种的基础，对菊花品种更新和产业升级具有重要意义。

国内外有众多学者先后对菊花种质资源进行了表型性状研究，并对菊花种质资源进行分析和整理，为加快优良种质资源的利用和菊花育种奠定了坚实基础[3-6]。近年来，随着生物技术的快速发展，如RAPD[7-8]、AFLP[9-10]、ISSR[11-12]、SSR[13-15]和SRAP[16-19]等多种分子标记技术也先后应用于菊花种质资源遗传多样性研究中，结果显示菊花在基因型上有丰富的遗传多样性。然而，结合表型性状和SRAP分子标记对盆栽小菊品种进行遗传多样性研究还鲜见报道。

 

本研究基于表型性状和SRAP分子标记技术，对国外引进的30份盆栽菊花品种资源进行遗传多样性分析，探讨其遗传多样性在形态和DNA水平上的关联，旨在为盆栽菊杂交育种过程中亲缘关系分析、杂交亲本的选配提供一定的参考。

 

1材料与方法

 

1.1材料

 

试验材料为课题组从国外引进的30个盆栽小菊品种（表1）。2017年下半年栽植于广州市白云区寮采村白云现代农业示范基地。SRAP引物为Li等[20]公布的通用引物，正/反向引物各8条，

共产生64对引物组合。所有引物经荧光标记，供机器读图。

 

1.2方法

 

1.2.1表型性状的测定

 

本试验选取14个数量性状（花径、花数、观花期、花梗长、头状花序高度、舌状小花长度、舌状小花宽度、叶长、叶宽、叶数、株高、茎粗、冠幅、节间距）和6个质量性状与多态性状（花色、花心颜色、叶缘裂刻深浅、茎颜色、叶基部形态和抗旱性）共20个表型性状，依据《植物新品种特异性、一致性和稳定性（DUS）测试指南—菊花》（中华人民共和国农业行业标准NY/T2228–2012）在盛花期对各观赏性状进行观测。每个品种调查10株，每个数量性状测量3次，取平均值。变异系数（CV）=（标准差SD/平均值x）×100%。

 

1.2.2SRAP扩增与引物筛选

 

采用常规CTAB法提取菊花叶片DNA。SRAP扩增体系总体积为25μL，其中含模板DNA2μL，10×PCRbuffer（含MgCl2）2.5μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH2O18.5μL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃1min，35℃1min，72℃1min，5个循环；然后再94℃1min，50℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，保存电泳胶图，由北京鼎国生物技术公司完成。

 

1.3数据统计与处理

 

1.3.1表型数据的统计分析与作图

 

数量性状数据直接记录，质量性状数据转换成相应数字代码。具体包括：花色（白色或近白色=1，黄绿色=2，绿色=3，淡黄色=4，黄色=5，橙色=6，粉红色=7，红色=8，浅紫色=9，紫色=10）；花心颜色（白色=1，绿色=2，黄绿色=3，淡黄色=4，黄色=5，橙黄色=6，橙色=7，红棕色=8，棕色=9，棕黑=10，紫黑色=11）；叶柄姿态（极向上=1，向上=3，平伸=5，向下=7，下垂=9）；叶基部形态（锐角=1，钝角=2，圆=3，平截=4，心形=5）；叶缘裂刻深浅（浅=3，中=5，深=7）；茎颜色（绿色=1，绿棕色或绿紫色=2，棕色=3，紫色=4）；抗旱性（根据自然环境10d不浇水后植株叶片的萎蔫程度来评价，抗旱=5，中抗=3，不抗旱=1），将相应数值录入Excel2010。表型性状的变异分析、主成分分析和基于欧式距离的聚类分析与作图均用SPSS18.0软件完成。

 

1.3.2SRAP条带统计分析与作图

 

利用GENESCAN3.1软件分析保存的胶图。参照荧光标记Marker（Rox500）大小（70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、490、500bp，共25条带）在70~500bp范围内每2bp读1次数，共读取216个数（相当于216个位点）。而后通过Binthere软件将提取的片段大小结果转变为0-1矩阵（有带的记为“1”，无带的记为“0”）。Excel2010统计总位点数和多态性位点数，计算多态性比率。用MEGA-X软件根据遗传距离进行NJ（neighborjoining）聚类分析和作图。