矮牵牛花发育相关基因Ph Ts2的克隆及功能分析 

 

摘  要：从矮牵牛‘幻想’中克隆了花发育相关基因 Ph Ts2，该基因 CDS 长 855  bp，编码 284 个氨基酸，具有保守的 adh-short 结构域。进化分析表明，Ph Ts2 蛋白与同科植物烟草和番茄的同源蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量 PCR 分析发现该基因在矮牵牛花药发育的早期特异性表达。

 

为分析其功能，构建 Ph Ts2 超量表达载体，转化了烟草，并对转基因烟草进行了鉴定：表型观测发现其花药形态异常，花粉数量减少；花粉活力和萌发率极显著降低；扫描电镜观测发现其花粉粒畸形，外壁纹饰不规则；半薄切片显示其绒毡层发育过程紊乱。该研究为培育雄性不育系提供了潜在的基因资源。 

 

矮牵牛（Petunia hybrida）由于花朵显著，遗传背景清晰，生长周期较短等，成为了分子遗传研究的模式植物（Gerats  &  Vandenbussche，2005，张慧琳  等，2019；周琴  等，2019）。商业化的矮牵牛品种多是通过杂交优势育种培育而来，因此，研究雄蕊发育及创制雄性不育系对于矮牵牛的育种具有重要的意义（Segatto et al.，2014）。 

 

课题组前期通过抑制差减杂交文库筛选到一个与矮牵牛花发育相关的基因，该基因与 Delong等（1993）从玉米中克隆得到的 TASSELSEED2（Ts2）基因有同源关系，故命名为 Ph Ts2（Yue et al.，2013）。玉米 Ts2 是一种性别决定基因，编码 1 种短链醇脱氢酶（short-chain  dehydrogenase），该基因在雄穗花序的雌蕊群原基次上皮细胞中的表达水平很高，特别是在雌蕊群开始退化前这一时期，而在其他花器官和花发育时期中的表达水平都很低。

 

玉米 Ts2 在雌蕊原基中的表达可以引起雌蕊败育从而产生单性雄花，这表明 Ts2 很可能是在其他一系列基因表达决定了花器官的类别和数量以后才发挥作用的（Delong  et  al.，1993）。研究者随后在鸭茅状摩擦禾中发现 gsf1 基因，其与 Ts2 高度同源，且突变体的表型与玉米相似，雌蕊退化，产生穗状单性雄花（Li  et  al.，1997）。后期研究表明，Ts2 不仅在雌蕊形成过程中诱导细胞死亡，还很可能具有调节或改变雌蕊形成途径中其他相关基因的活性及功能（Malcomber  &  Kellogg，2006）。

 

叉枝蝇子草中的 STA1 基因和拟南芥中的 ATA1是 Ts2 的同源基因，但它们与 Ts2 有着不同的表达模式和功能：Ts2 在雄穗花序的雌蕊群发育时表达，而 STA1 和 ATA1 只在花药绒毡层中特异性表达，可能在绒毡层的发育过程中具有保守的功能，并不是在雌蕊原基中表达引起雌蕊败育从而产生单性雄花（Lebel-Hardenack  et  al.，1997）。盛云燕等（2014）发现甜瓜 Cm TS2 可能参与花器官发育，尤其是雌花的发育。目前还没有关于矮牵牛中 Ts2同源基因的报道。 

 

1   材料与方法 

 

1.1   试验材料及 Ph Ts2 的克隆与生物信息分析 

 

基因克隆及总 RNA 提取所用材料为矮牵牛‘幻想’，种植于华中农业大学花卉基地。遗传转化所用的烟草（Nicotiana  tabacum‘Xanthi’）为本实验室保存的组培苗。植物超量表达载体p CAMBIA2300 和根癌农杆菌菌株 EHA105 均由本实验室保存。引物序列由上海桑尼生物科技有限公司合成。 

 

设计基因特异性引物 Ph Ts2-F（5′-CGGGATCCACGCGGGACCAATTGTTG-3′）和 Ph Ts2-R（5′-GC GTCGACTGCCCGCACAGCAATGAAC-3′），从矮牵牛‘幻想’中扩增 Ph TS2 完整的 c DNA 序列，连接到 p MD18-T 载体上并进行测序。通过 FGENESH 软件预测 Ph Ts2完整的编码序列（CDS）。使用在线工具 Prot Param进行序列基本特征分析。Plant-m PLoc用来预测其亚细胞定位（Chou & Shen，2010）。利用 Pfam 网站分析其保守结构域。 

 

1.2   Ph Ts2 的表达模式分析 

 

参照 Yue 等（2017）的方法，以花芽长度代表发育时期，取长度为 0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.5 cm 的花芽及对应的花药，另取当日开放的花朵的萼片、花瓣、花药、雌蕊，以及植株的幼根、幼茎、幼叶、盛开的花，提取各样品的总 RNA，反转录合成第 1 链 c DNA 后，使用引物q Ph Ts2-F（5′-TGGTAGGGCAAAGAGGGAGTC-3′）和 q Ph Ts2-R（5′-CCCGCACAGCAATGAACC-3′）进行实时荧光定量分析 Ph Ts2 的表达水平。 

 

1.3   Ph Ts2 超表载体的构建及烟草的转化 

 

用碱裂解法提取超量表达载体 p CAMBIA2300 质粒及 p MD18-T-Ph Ts2 质粒，并用限制性内切酶（Ta Ka Ra）Bam HⅠ和 SalⅠ进行双酶切。T4 DNA 连接酶（Ta Ka Ra）连接，从而构建 p CAMBIA2300- Ph Ts2 超量表达载体。 

 

将 p CAMBIA2300-Ph Ts2 重组质粒电转化农杆菌 EHA105 感受态细胞。使用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，经过共生培养，筛选培养后将抗性芽转入生根培养基中诱导生根，然后将获得的生根苗炼苗后进行移栽，成活的即为 T0代转基因植株（Ma et al.，

2011）。 

 

1.4   转 Ph Ts2 烟草 T0代的鉴定及花器官观测 

 

利用 CTAB 法提取转基因烟草 T0代 DNA，用 35S-F（5'-ACGCAATCCCACTATCCTTC-3'）和基因下游特异引物 Ph Ts2-R 进行 PCR 检测。PCR 反应条件：94  ℃预变性 4 min；94  ℃变性 30 s，60  ℃复性 30 s，72  ℃延伸 1 min，36 个循环；72  ℃延伸 10 min，20  ℃保温。用 1%琼脂凝胶电泳检测扩增产物。 

 

选取 7 株 PCR 检测为阳性并与野生型存在一定差异表型的 Ph Ts2 转基因 T0代烟草进行半定量RT-PCR 分析。取 1 ~ 1.5 cm 长幼嫩花芽中的花药提取 RNA，反转录合成第一链 c DNA，稀释 10 倍作模板，以野生型烟草 c DNA 为阴性对照，所用引物为 q Ph Ts2-F 和 q Ph Ts2-R，以烟草 β-actin 基因作为内部参照（Tian et al.，2019），进行 PCR 扩增。PCR 产物经 2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。 

 

基于 Ph Ts2 花药早期特异性表达的特性，主要对转基因植株的花器官进行观测。 

 

1.5    转基因烟草 T1代的花粉育性检测 

 

分别对野生型和 Ph Ts2 转基因烟草 T0代进行自交授粉，同时用野生型烟草的花粉对转基因植物进行授粉，并对果实的发育情况进行观察。Ph Ts2 转基因烟草 T0代自交留种所育成的实生苗为 T1代。提取 T1代植株的 DNA 进行 PCR 检测，以鉴定阳性株系。同时种植了 8 株野生型作为对照。

 

于盛花期采集野生型及转基因 T1代阳性植株即将开放的花朵，选择最长花丝上的花药进行醋酸洋红染色及花粉离体萌发试验，统计染色率（染成深红色的花粉粒数与花粉粒总数的百分比）和萌发率（萌发花粉粒数与花粉粒总数的百分比），计算花粉的生活力和萌发力（Huang et al.，2015）。每个株系进行 3 次重复。 

 

1.6    转基因烟草 T1代花粉形态的扫描电镜观测和花药发育半薄切片观测

 

分别将野生型和转基因 T1代烟草的 3 个即将开放的花蕾（花芽发育到接近开花的状态）剖开，选取最长花丝上着生的花药保存于 1%的戊二醛溶液中，进行缓冲液清洗、脱水、置换、临界点干燥、喷镀白金膜等过程，最后在扫描电子显微镜下观察花药形态（Bray et al.，

1993）。 

 

参考 Porceddu 等（1999）的方法，以花芽长度作为花药发育时期界定的指标。分别取野生型及转基因 T1代烟草中长度分别为 0.3、0.5、0.8、1.5、2.5 和 3.5 cm 的花芽中的花药，使用 Technovit 7100 Liquit 对材料进行包埋，进行半薄切片观察（Yue et al.，2016）。